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細胞周期分析是分子生物學常用的實驗方法，尤其在抗腫瘤藥物研究上使用普遍。但細節(jié)若是處理不好，做得再多也做不出正確的、好看的分布圖。如何準確制備細胞周期測試的樣品，科研實驗行業(yè)的小伙伴們一起來了解下！

先簡單介紹下實驗原理

碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，可以與 DNA 和 RNA 結(jié)合，但其不能透過正常的細胞膜，所以對活細胞無染色作用。可通過冷乙醇或其他破膜劑的作用，使細胞膜通透性增加。PI 進入細胞內(nèi)后，選擇性地與核酸結(jié)合，RNase 裂解 RNA 后，細胞內(nèi)染料的熒光量與細胞核內(nèi)的 DNA 含量成正比。通過流式細胞儀檢測單個細胞熒光強度得到相對 DNA 含量，根據(jù)各個時相 DNA 含量不同，將細胞分為不同的周期。

具體操作流程及注意事項

1、將對數(shù)期的細胞接種于 6 孔板中（2×105 個 / 孔，根據(jù)細胞大小、增值速度適當調(diào)整），每孔加 2 ml 培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2、細胞貼壁后（根據(jù)細胞具體情況），去除培養(yǎng)基，分別加入培養(yǎng)基配置的不同濃度藥物 1 ml 孵育（不使用造成細胞大量死亡的藥物濃度和孵育時間）。

3、藥物作用結(jié)束后，收集培養(yǎng)液，1500 rpm，離心 4 min。一定要一并收集漂浮的死細胞，不然會嚴重影響結(jié)果。

4、消化收取貼壁細胞，吹打過程一應要輕柔充分，避免細胞受損、細胞黏連；離心轉(zhuǎn)速為 2000 rpm，離心 4 min（離心轉(zhuǎn)速不要超過 2000 rpm，也可以采用 1000 rpm，離心 5 min），PBS 洗 3 遍，以去除培養(yǎng)基、藥物殘留及細胞碎片。合并培養(yǎng)液和貼壁細胞。

5、細胞沉淀中加入少量 PBS，輕柔充分重懸細胞。然后將重懸的細胞加入到 4℃ 預冷的 70% 冰乙醇中固定，輕輕吹打均勻（切記！！！不要將冰乙醇加入到細胞中，這樣會造成細胞黏連，嚴重影響結(jié)果），封口膜封口，4℃ 過夜。

6、2000 rpm 離心 4 min，吸去固定液，PBS 洗兩次，以去除固定液。

7、細胞中加入含 PI（50 μg/ml）、RNaseA（50 μg/ml，去除 RNA）和曲拉通（1%，通透細胞膜）的工作液 200 μl（曲拉通粘性大，配置時一定要渦旋，保證混合均勻），室溫避光孵育 30 min。按照步驟 1 中的鋪板細胞數(shù)，這個體積的工作液可以保證測試時的細胞濃度正合適。

8、流式細胞儀檢測細胞周期。染色后，可以使用 PBS 去除染液，也可選擇不處理，親測沒有影響。

9、FlowJo 軟件分析細胞周期時相分布。

實驗人注意！注意！！注意！！！

整個過程一定要盡量降低操作對細胞的損傷，要吹打輕柔，減少離心次數(shù)，轉(zhuǎn)速不要超過 2000 rpm。

消化細胞時要保證細胞吹散，不要有細胞黏連，一旦這一步驟沒有消化充分，后面很難再將細胞吹散，后果嚴重。

測試時細胞濃度一定要根據(jù)流式細胞儀的檢測范圍，不然可能會影響準確度。